他是大学士潘世恩之孙。与潘世恩、潘世璜一起被称为书法“苏州三杰”。光绪年间官至工部尚书，数掌文衡殿试，在南书房近四十年。在收藏界，人们叫他“潘神眼”。他收藏的国宝级文物大盂鼎目前存在中国历史博物馆，大克鼎目前存放在上海博物院，都是我国青铜器藏品中的至尊。
潘祖荫生长于北京，祖籍苏州。他的祖父为乾隆癸丑科状元潘世恩，官至太傅、武英殿大学士。他的父亲潘曾绶，字绂庭，官至内阁侍读。他的叔祖是乾隆乙卯科探花潘世璜。
1848年，潘祖荫18岁，恰值祖父潘世恩80大寿，道光皇帝恩赏潘祖荫为举人。1852年，考中一甲第三名(探花)，授翰林院编修。1854年，历任国史馆协修、候补侍读、实录馆纂修。1856年，历任功臣馆纂修、会试同考官、侍读、咸安宫总裁、南书房行走、文渊阁校理，因捐备军饷赏戴花翎。1857年，历任日讲起居注官、侍讲学士。1858年，英法联军入侵天津，上书请战，历任陕甘乡试正考官、国子监祭酒、侍读学士。
潘祖荫后半生在京，身居朝中高位。提携了许多对国家有用的干才，这些人后来成为著名人物，左宗棠就是其中的一个。
据说，光绪初叶，潘祖荫主持刑部，有司员听说潘祖荫好文雅，想巴结一下，忙写诗数十首，恭楷录在正堂上，见面时，作揖呈上。潘祖荫当时翻阅，一见首篇题为《跟二太爷阿妈逛庙》八字，不禁狂笑，冠帽上的缨子几乎掉下来。那个巴结的司员面无人色，忙倒退而去。
光绪十六年，顺天州县水灾，潘祖荫与府尹筹放义赈、添设二处粥厂。秋天，潘祖荫患病，仍不忘上奏请拨银米以备灾民过冬，皇帝答应他的请求并且施行。潘祖荫病情更严重，不得不告假，三日之后，潘祖荫积劳病故，年61岁，官至工部尚书。
皇帝赐谥号文勤，赠太子太傅。宝坻士绅集资为潘祖荫立祠，由地方官春秋致祭，皇帝下诏同意。潘祖荫的墓在江苏苏州木渎区。
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